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隨著SARS-CoV-2 Delta變體（B.1.617.2）對未接種疫苗的人群造成破壞，以及COVID-19病例在世界各地激增，這種大流行病遠(yuǎn)未結(jié)束。盡管在過去一年半里SARS-CoV-2診斷測試的發(fā)展速度令人印象深刻，但絕大多數(shù)患者的樣品仍然必須被送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理，這拖慢了COVID-19病例追蹤的速度。如果要檢測樣品中的特定SARS-CoV-2變體，就必須對其進(jìn)行基因測序，這需要更多的時(shí)間和資源。

如今，在一項(xiàng)新的研究中，來自美國哈佛大學(xué)威斯生物啟發(fā)工程研究所、麻省理工學(xué)院和波士頓地區(qū)幾家醫(yī)院的研究人員開發(fā)出一種廉價(jià)的、基于CRISPR的診斷測試，允許用戶在家里使用唾液樣品對自己進(jìn)行SARS-CoV-2及其多種病毒變體的測試，而不需要額外的儀器。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2021年8月6日的Science Advances期刊上，論文標(biāo)題為“Minimally instrumented SHERLOCK (miSHERLOCK) for CRISPR-based point-of-care diagnosis of SARS-CoV-2 and emerging variants”。

這種稱為Minimally Instrumented SHERLOCK（miSHERLOCK）的診斷設(shè)備易于使用，提供的結(jié)果可在一小時(shí)內(nèi)由配套的智能手機(jī)應(yīng)用程序讀取和驗(yàn)證。它在實(shí)驗(yàn)中成功區(qū)分了SARS-CoV-2的三種不同變體，并且可以迅速重新配置以檢測更多的變體，如Delta變體。該設(shè)備可以用三維打印機(jī)和常見的部件組裝，價(jià)格約為15美元，重復(fù)使用這些部件使單個(gè)檢測的成本降至6美元。

論文共同第一作者、哈佛大學(xué)威斯生物啟發(fā)工程研究所和麻省理工學(xué)院的博士后研究員Helena de Puig說，“miSHERLOCK消除了將患者樣品運(yùn)送到集中測試地點(diǎn)的需要，并大大簡化了樣品制備步驟，使患者和醫(yī)生能更快、更準(zhǔn)確地了解個(gè)人和社區(qū)的健康狀況，這在不斷發(fā)展的大流行病中至關(guān)重要。”

從供應(yīng)鏈到SHERLOCK

作為波士頓兒童醫(yī)院專門研究傳染病的兒科講師，論文共同第一作者Rose Lee博士已在COVID-19大流行病的前線工作了一年多。她在診所的經(jīng)歷為最終開發(fā)miSHERLOCK的項(xiàng)目提供了靈感。

Lee說，“以前在醫(yī)院里隨處可見的一些簡單的東西，比如鼻咽拭子，突然變得難以獲得，因此常規(guī)的樣品處理程序被打亂了，這在流行病背景下是一個(gè)大問題。我們團(tuán)隊(duì)開展這個(gè)項(xiàng)目的動(dòng)機(jī)是為了消除這些瓶頸，在不太依賴全球供應(yīng)鏈的情況下為COVID-19提供準(zhǔn)確的診斷方法，并且還可以準(zhǔn)確地檢測開始出現(xiàn)的病毒變體?！?/p>

對于他們診斷設(shè)備的SARS-CoV-2檢測部分，這些作者選擇了論文通訊作者、哈佛大學(xué)威斯生物啟發(fā)工程研究所核心教員Jim Collins博士的實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的基于CRISPR的技術(shù)，稱為SHERLOCK（specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking）。SHERLOCK利用CRISPR的“分子剪刀”在特定的位點(diǎn)切割DNA或RNA，這還有一個(gè)額外的好處：這種特定類型的分子剪刀也會(huì)切割周圍區(qū)域的其他DNA片段，使其能夠切割攜帶熒光信號的單鏈核酸探針分子，從而產(chǎn)生表明靶標(biāo)已被成功切割的熒光信號。

該診斷程序只需要用戶將口水（唾液）吐進(jìn)樣品制備室，然后將收集盤轉(zhuǎn)移到反應(yīng)室，并按下柱塞，從而激活反應(yīng)，并將交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)降到最低。圖片來自Science Advances， 2021， doi：10.1126/sciadv.abh2944。

這些作者創(chuàng)建了一種SHERLOCK檢測，旨在切割SARS-CoV-2的核蛋白（nucleoprotein， NP）編碼基因的特定區(qū)域，該特定區(qū)域在該病毒的多個(gè)變體中是保守的。當(dāng)這種稱為Cas12a的分子剪刀成功地結(jié)合并切割NP基因時(shí)，附近的單鏈DNA探針也被切割，從而產(chǎn)生熒光信號。他們還創(chuàng)建了額外的SHERLOCK檢測，旨在靶向刺突蛋白（S蛋白）序列中的一組病毒突變，這些突變代表了三種SARS-CoV-2病毒變體：Alpha、Beta和Gamma。

有了能夠可靠地在美國食品藥品管理局（FDA）授權(quán)的診斷測試的可接受濃度范圍內(nèi)檢測病毒RNA的檢測方法，這些作者接下來集中精力解決診斷中可能最困難的挑戰(zhàn)：樣品制備。

吐口水、等待、掃描

論文共同第一作者、哈佛大學(xué)威斯生物啟發(fā)工程研究所臨床研究員Xiao Tan博士說，“當(dāng)你測試樣品中的核酸[如DNA或RNA]時(shí)，你需要做很多步驟來制備樣品，以便你能真正提取和擴(kuò)增這些核酸。你必須在樣品運(yùn)送到檢測機(jī)構(gòu)的過程中保護(hù)它，而且如果你處理的是可傳播的疾病，還要確保它不具有傳染性。為了使它成為一種真正易于使用的診斷測試，我們必須盡可能地簡化它?！?/p>

這些作者選擇使用唾液而不是鼻咽拭子樣品作為他們的收集方法，因?yàn)橛脩舾菀资占僖?，而且已有研究表明SARS-CoV-2在感染后的更多天內(nèi)可在唾液中檢測出來。但是未經(jīng)處理的唾液也帶來了自身的挑戰(zhàn)：它含有降解各種分子的酶，產(chǎn)生的假陽性率很高。

這些作者開發(fā)了一種新技術(shù)來解決這個(gè)問題。首先，他們在唾液中加入了兩種名為DTT和EGTA的化學(xué)物質(zhì)，并將樣品加熱到95°C 3分鐘，這就消除了未經(jīng)處理的唾液中的假陽性信號，并裂開任何病毒顆粒。然后他們加入了一種多孔膜以便在其表面捕獲RNA，最后可以直接加入到SHERLOCK反應(yīng)中以產(chǎn)生檢測結(jié)果。

為了將唾液樣品制備和SHERLOCK反應(yīng)整合到一種診斷設(shè)備中，這些作者設(shè)計(jì)了一種簡單的電池供電設(shè)備，有兩個(gè)腔室：一個(gè)加熱的樣品制備室和一個(gè)不加熱的反應(yīng)室。用戶向樣品制備室吐口水（唾液），對它進(jìn)行加熱，等待三至六分鐘，唾液就會(huì)進(jìn)入過濾器。用戶取出過濾器并將其轉(zhuǎn)移到反應(yīng)室的柱子上，然后按下柱塞，將過濾器放入反應(yīng)室，并刺穿蓄水池，以激活SHERLOCK反應(yīng)。55分鐘后，用戶通過有色透光器窗口觀察反應(yīng)室，確認(rèn)是否存在熒光信號。他們還可以使用一種配套的智能手機(jī)應(yīng)用程序，分析智能手機(jī)攝像頭記錄的像素，從而提供明確的陽性或陰性診斷結(jié)果。

這些作者用27名COVID-19患者和21名健康患者的臨床唾液樣品測試了他們的診斷設(shè)備，發(fā)現(xiàn)miSHERLOCK在96%的時(shí)間里能正確識(shí)別COVID-19陽性患者，在95%的時(shí)間里能正確識(shí)別無該疾病的患者。他們還通過將含有代表每種病毒變體的突變的全長合成病毒RNA加入健康人的唾液中，測試了這種診斷設(shè)備檢測SARS-CoV-2 Alpha、Beta和Gamma SARS-CoV-2變體的性能，并發(fā)現(xiàn)該設(shè)備在各種病毒RNA濃度下都有效。

論文共同第一作者、Collins實(shí)驗(yàn)室研究助理Devora Najjar說，“miSHERLOCK的優(yōu)點(diǎn)之一是它是完全模塊化的。該設(shè)備本身與檢測方法是分開的，因此你可以整入不同的檢測方法來檢測你想要檢測的特定RNA或DNA序列。該設(shè)備的成本約為15美元，但大規(guī)模生產(chǎn)將使之降至約3美元?？梢栽诖蠹s兩周內(nèi)建立新靶點(diǎn)的檢測方法，從而能夠快速開發(fā)針對COVID-19和其他疾病的新變體檢測方法?！?/p>

為現(xiàn)實(shí)應(yīng)用做好準(zhǔn)備

這些作者在構(gòu)建他們的診斷設(shè)備時(shí)考慮到了低資源環(huán)境，因?yàn)檫@種大流行病讓人們看到了世界不同地區(qū)之間在醫(yī)療服務(wù)方面存在的巨大不平等現(xiàn)象。該設(shè)備的組件可以由任何能夠使用三維打印機(jī)的人制造，相關(guān)的資料文件和電路設(shè)計(jì)都可以在網(wǎng)上公開獲得。增加一種智能手機(jī)應(yīng)用程序也是針對資源有限的環(huán)境，因?yàn)橐苿?dòng)電話服務(wù)幾乎在世界任何地方都可以使用，甚至在步行難以到達(dá)的地區(qū)。他們渴望與那些有興趣大規(guī)模生產(chǎn)miSHERLOCK以進(jìn)行全球分銷的制造商合作。

Collins說，“當(dāng)miSHERLOCK項(xiàng)目開始時(shí)，幾乎沒有進(jìn)行SARS-CoV-2變體監(jiān)測。我們知道，在評估COVID-19對當(dāng)?shù)睾腿蛏鐓^(qū)的長期影響時(shí)，這種病毒變體跟蹤將是非常重要的，所以我們推動(dòng)自己構(gòu)建一種真正分散管理的、靈活的、用戶友好的診斷平臺(tái)。通過解決樣品制備問題，我們已經(jīng)確保這種設(shè)備實(shí)際上準(zhǔn)備好供消費(fèi)者使用，我們很高興與工業(yè)伙伴合作，使其商業(yè)化?！?/p>

哈佛大學(xué)威斯生物啟發(fā)工程研究所創(chuàng)始主任Don Ingber博士說，“通過將前沿生物技術(shù)與低成本材料相結(jié)合，這個(gè)研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建出一種強(qiáng)大的診斷設(shè)備，可以由沒有高級醫(yī)學(xué)學(xué)位的人在當(dāng)?shù)刂圃旌褪褂?。這是一個(gè)完美的例子，說明了哈佛大學(xué)威斯生物啟發(fā)工程研究所的使命：將改變生活的創(chuàng)新交到需要它們的人手中?！保ㄉ锕?Bioon.com）