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回答一抗的孵育時間與溫度、抗體濃度有關。一般情況下，在37℃的條件下，孵育1-2小時左右。在室溫的條件下，孵育3小時左右。在4℃的條件下，孵育18-24小時左右。如果一抗的濃度過高或者是孵育時間過長，會導致非特異性吸附，增加洗滌的難度，最終因洗滌不徹底而出現(xiàn)非特性顯色。

一、一抗孵育時間，不能超過多久

1、一抗的定義

一抗指的是能夠和非抗體性抗原（特異性抗原）特異性結(jié)合的蛋白，也就是平常所說的抗體。二抗指的是能和抗體結(jié)合的抗體，主要用于檢測抗體的存在，放大一抗的信號。

2、一抗的孵育時間

（1）一抗的孵育時間與溫度，抗體濃度有關。一般情況下，在37℃的條件下，孵育1-2小時左右。在室溫的條件下，孵育3小時左右。在4℃的條件下，孵育18-24小時左右。

（2）如果一抗的濃度過高或者是孵育時間過長，會導致非特異性吸附，增加洗滌的難度，最終因洗滌不徹底而出現(xiàn)非特性顯色。

二、雙抗體夾心法檢測未知抗原

1、包被

用0.05M碳酸鹽包被緩沖液（ph9.6）對抗體進行稀釋，直至蛋白質(zhì)含量為1-10μg/ml為止。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。第二天的時候，去掉孔內(nèi)溶液，然后用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。

2、加樣

將0.1ml經(jīng)過稀釋的待檢樣品放到反應孔中，在37℃的環(huán)境條件下孵育1小時，然后進行洗滌。

3、加酶標抗體

在各個反應孔中，加入0.1ml新鮮稀釋的酶標抗體，在37℃的環(huán)境條件下，孵育0.5-1小時，然后進行洗滌。

4、加底物液顯色

在各個反應孔中，加入0.1mlTMB底物溶液（應當臨時配制），37℃的環(huán)境條件下10-30分鐘。

5、終止反應

在各個反應孔孔中，加入0.05ml的2M硫酸。

6、結(jié)果測試

（1）在白色背景下，用肉眼進行觀察即可。反應孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺。

（2）在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值，如果大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。